Le jeu débute par un remake de l'affrontement entre Duke Nukem et le Cycloid Emperor dans le stade de Duke Nukem 3D. Une fois l'empereur vaincu, on se rend compte que Duke Nukem jouait en réalité à son propre jeu, en compagnie des jumelles Holsom. Duke apprend ensuite qu'un vaste vaisseau mère extra-terrestre vient d'apparaître dans le ciel de Las Vegas. Il se rend à la Duke Cave où il reçoit l'ordre du Président de ne pas intervenir, car les extra-terrestres sont cette fois pacifiques. Il se fait cependant attaquer par des extra-terrestres et riposte. Il assiste alors impuissant à l'enlèvement des femmes par les extra-terrestres. Il se dirigera vers le Duke Dome pour les chercher…